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细胞冻存是细胞生存的重要要领之一。运用冻存技巧将细胞置于-196~C液氮中低温生存,能够使细胞暂时离开生长状态而将其细胞特点生存起来,在的时间苏醒细胞用于推行。并且适度的生存必定量的细胞,能够防止因正在造就的细胞被污染或其他意外变乱而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。除此之外,还能够运用细胞冻存的情势购置、寄赠、互换和运输某些细胞。 细胞冻存时向造就基中插手掩护剂—浓度5%~15%的甘油或二甲基亚砜「DMSO」,可使溶液冰点低落,加之在迟缓冻结前提下,细胞内水分透出,裁减了冰晶酿成,从而制止细胞损伤。尺度冷冻速度开头为-1 到 -2℃/min,当温度低于-25℃时可加快,到-80℃之后可直接投入液氮内「-196℃」。
而今常用的掩护剂为二甲亚砜「DMSO」和甘油,它们对细胞**性,分子量小,融化度大,易穿透细胞。
实行质料
仪器:液氮罐、冻存管「塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶」、离心管、吸管、离心机等
试剂:0.25%胰酶、造就基、含掩护剂的造就基(即冻存液)
附:冻存液配制:造就基加入甘油或DSMO,使浓度达5-20%。掩护剂的种类和用量视细胞而。配好后4℃下生存。
实行步调
1.消化细胞,将细胞悬液网络至离心管中。
2.1000rpm离心10分钟,弃上清液。
3.沉淀加含掩护液的造就,计数,调解至5106/ml左右。
4.将悬液分至冻存管中,每管1ml。
5.冻存管口封严。如用安瓿瓶火焰封口,封口肯定要严,否则复苏时易泛起爆裂。
6.贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。
7.按下列次序降温:室温→4℃「20分钟」→冰箱冷冻室「30分钟」→低温冰箱「-30℃ 1小时」→气态氮「30分钟」→液氮。
细致:把持时应警惕,免得液氮冻伤。液氮定期查抄,添补,绝对不克不及挥发洁净,一样通常三十立升的液氮能用1~1.5月。